Western Blot过程中常见的原因问题及可能原因分析
2011-08-10 17:49 · Chasel常见的问题及可能原因分析
| 问题 | 可能原因 | 验证或解决办法 | |
| 背景高 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100% 甲醇浸透膜5-10min | |
| 洗膜不充分 | 增加洗液体积和洗涤次数 | ||
| 阻断不充分 | 增加封闭液孵育时间，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。如果阳性对照有结果，缩短转移时间 | ||
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，延长孵育时间 | ||
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。保证抗体的特异性 | ||
| 蛋白降解 | 使用新鲜制备的标本，或者阳性条带比较弱 | 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，选择无交叉反应的封闭剂。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。只针对重链的） |
| 一抗的特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，酪蛋白等） | ||
| 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 | ||
| 检测过程中膜干燥 | 保证充分的反应液，可以减少非特异性条带 | ||
| 蛋白上样量过大 | 降低上样量 | ||
| 封闭剂中有聚集体 | 使用前过滤封闭试剂 | ||
| HRP耦联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | ||
| 一抗失效 | 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 | ||
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | ||
| 膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 | ||
| 靶蛋白分子量小于10Kd | 选择小孔径的膜，如果不显色则说明酶失活了。或者提高温度。一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。从而沉淀在凝胶中，并使用蛋白酶抑制剂 | ||
| 二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 | ||
| 抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、其他操作过程不变，洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 | ||
| 没有阳性条带， | |||
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | ||
| 抗体活性降低 | 选择在有效期内的抗体，
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